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                多肽的纯度与多肽的净含量

                时间:2022-05-01浏览次数:794

                一、多肽的纯度


                多肽的纯度是指HPLC方法在214nm处检测到的目标多肽的含量(214nm是肽链的吸收波长),紫外分光光度计检测不到水和残留的盐份。可发现其他的杂质包括:缺失序列(缺失了一个或多个氨基酸残基的靶序列),截断序列(加帽过程中产生的序列)脱保护不完全序列(产生于整个合成过程或最后的裂解过程)。

                多肽纯化不涉及水和盐。HPLC纯化会产生少量的TFA,如:游离的∮氨基末端和其他侧链如Arg、Lys、His都可生成少量TFA杂质。通常交付的多肽多含有微量TFA和残留水。即使处于冻干状态,水也会因共价结合的能力不同而〓不同程度地存在着。


                在多肽中还存在哪些其他物质(杂质)?

                杂质

                纯化前的多肽

                纯化后的多肽(HPLC)

                缺失序列1

                ?

                ?

                截断序列2

                ?

                ?

                脱保护不完全序列3

                ?

                ?

                裂解过程中被修改的序列4

                ?

                ?

                DTT (dithiothreitol,二巯基苏糖醇)

                ?

                ?

                TFA (trifluoroacetic acid,三氟乙酸)

                ?

                ?

                Acetic acid(醋酸)

                ?

                ?

                某个氨基酸发生了副反应的多肽,如脯氨酸异构化等。

                ?

                ?

                纯化前的多肽中包含的杂质包括多肽和非多肽物质, 纯化后的多肽中包含的杂质除了TFA盐,大多数为序列被修改的多肽。

                1、缺失了一个或多个氨基酸残基的靶序列

                2、为避免缺失序列的产生而进行的加帽操作,截断序列即产生于加帽过程中产生于整个合成过程或最后的裂解过程

                3、保护基重新附着在多肽的其他位置


                二、肽净含量

                肽净含量不同于多肽纯度,多肽纯度仅指多肽本身所含肽产品的含量及杂质的含量,不包括水份等杂质。而多肽含量则是指样品中肽类物质相对于非肽类物质所占的百分比。通常一条多肽产品中除了多肽本身还包括生产过程中带入的非盐组份,如水,被吸收的溶剂、配位离子和盐等。即使在严格的冻干状态下,也会吸收微量的水。因此一条多肽即使纯度达到99%,因为产品中还包含水份及有机盐分等,它的含量可能也只有70-80%。因纯化批次和冻干工艺不同☉,也会导致肽的净含量有所不同。一般我们可以用N元素分析或氨基酸分子的方法来检测多肽的净含量。如果多肽序列中有Trp或Tyr可以采用紫外的方法分析肽含量,根据摩尔消光系数:

                Tryptophan 5560 AU/mmole/ml

                Tyrosine 1200 AU/mmole/ml

                (at 280 nm at neutral pH using a 1-cm cell)

                一条多肽的摩尔消光系数可以根据每个Trp或Tyr的系数进行加和,然后根∩据所测到的在280nm处的吸收值通过公式进行计算

                mg peptide per ml = (A280 x DF x MW) / e

                A280   在280 nm实际吸收值(1-cm cell),

                DF   是稀释因数, MW 多肽分子量☆

                e     多肽的摩尔消光系数




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